什么是液相色譜?

歷史概述和定義

液相色譜的定義是二十世紀(jì)早期由俄羅斯植物學(xué)家 Mikhail S. 茨維特提出的。他最先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來分離從植物中提取的化合物[樹葉色素]。茨維特用顆粒填滿開口的玻璃柱。他發(fā)現(xiàn)兩種特殊的材料，粉筆末(碳酸鈣)和氧化鋁很有用。他將樣品[混勻植物葉的溶劑提取物]倒入柱中，并讓樣品流過顆、粒床。隨后加入純?nèi)軇ｋS著樣品由于重力自上而下流過柱子，可看到不同顏色的譜帶被分開，因?yàn)橛行┙M分比另外一些移動(dòng)得快。他將這些分開的不同顏色的譜帶與樣品中原有的不同化合物相關(guān)聯(lián)。他還根據(jù)每一種化合物對(duì)填料的化學(xué)親和性強(qiáng)弱，提出了分析這些化合物的分離規(guī)律。與顆粒填料有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)慢，與溶劑有較強(qiáng)親和性的化合物移動(dòng)快。這個(gè)過程可這樣描述:樣品中的化合物在流動(dòng)的溶劑(流動(dòng)相)與固體顆粒(固定相)間的分布不一樣。這樣使每一種化合物以不同的速度移動(dòng)，從而產(chǎn)生了化合物之間的分離。

茨維特使用色譜法 chromatography [來自希臘字， chroma 意思是顏色， graphy 意思是記錄 - 直譯為顏色記錄] 來描述他的彩色試驗(yàn)。[令人好奇的是, 俄羅斯名字茨維特意思是顏色。]今天，液相色譜法,以各種形式，已成為分析化學(xué)中十分有力的工具之一。

技術(shù)1. 樣品被點(diǎn)在固定在玻璃板上的薄層色譜顆粒[固定相]上，并流過薄層[圖 B]。玻璃板的底端放置在溶劑中。由毛細(xì)作用產(chǎn)生的流動(dòng)使溶劑[流動(dòng)相]擴(kuò)散到干燥的顆粒層并沿玻璃板向上移動(dòng)。這種技術(shù)被稱為薄層色譜法或 TLC。

技術(shù) 2. 在圖 C 中, 樣品被點(diǎn)在紙上[固定相]。溶劑[流動(dòng)相] 加在樣品點(diǎn)的中心以產(chǎn)生向周圍的輻射流動(dòng)。這是紙層析的一種方式。[傳統(tǒng)的紙層析色譜和直線流動(dòng)的薄層色譜是類似的操作方式。]上圖中，相同的黑色 FD 和 C 染料被點(diǎn)在紙上。

圖 C: 紙層析法

當(dāng)和薄層色譜板比較的時(shí)候，請(qǐng)注意這種特殊紙張分離能力的區(qū)別。綠色圓環(huán)表示這張紙無法分離黃色和藍(lán)色染料，但它可以將紅色染料分離開來。下圖中，由同樣的黃色和藍(lán)色染料組成的一個(gè)綠色樣品點(diǎn)在紙上。如你能預(yù)料的，這張紙無法分離這兩個(gè)染料。在圖中，由紅色和藍(lán)色組成的紫色樣品被點(diǎn)在紙上，它們被分離得
很好。

技術(shù)3.在這個(gè)十分有效的方法中，樣品流進(jìn)一個(gè)柱子或填有適當(dāng)顆粒[固定相]的柱管裝置。這些顆粒稱為色譜填料。溶劑[流動(dòng)相]流過這個(gè)裝置。在固相萃取中[SPE]，樣品被裝入柱管里，溶劑攜帶樣品流出這個(gè)裝置。正如在茨維特的試驗(yàn)中，樣品中化合物由于在管路中的流動(dòng)速度不同而得以分開。黑色樣品被放入柱管里。每一步使用不同溶劑得到分離。

 

圖 D-1: 柱色譜法 - 固相萃取 [SPE]

當(dāng)使用管路的形式時(shí)，有幾種方法可以產(chǎn)生流動(dòng)。重力或真空可用在不能承受壓力的柱子上。特別是，本試驗(yàn)中使用的顆粒粒徑較大[大于五十微米]，所以產(chǎn)生的流動(dòng)阻力很小。開口玻璃柱[茨維特的實(shí)驗(yàn)]是個(gè)典型的例子。除此之外，小型塑料柱，典型的例子是針筒的形狀，可裝入填充物顆粒用于分離樣品。這種方法稱為固相萃取[SPE]。在此，管狀的色譜裝置稱為固相萃取小柱，通常在真空助力下流動(dòng)，被用來凈化復(fù)雜樣品以便進(jìn)一步分析。要想提高分離能力，必須使用粒徑小的填料顆粒[小于十微米]。然而，小顆粒對(duì)流動(dòng)產(chǎn)生更大的阻力，所以要獲得預(yù)期的溶劑流速，需要更高壓力。必須設(shè)計(jì)能承受更高壓力的泵和柱子。利用中高壓力使溶劑流過色譜柱的方法，就稱為 HPLC。

圖 D-2: HPLC柱

什么是高效液相色譜法[HPLC]?

縮寫 HPLC, 引自 Csaba Horváth 教授之后在 1970 年匹茨堡大會(huì)上的文章，原指在填料柱中產(chǎn)生所需的流速需要高壓 (high-pressure) 這個(gè)事實(shí)。早期的泵只能承受 500 psi [35bar]。這就被稱為高壓液相色譜法[HPLC]七十年代早期取得極大進(jìn)步。新型的高壓液相色譜儀器可以承受 6,000 psi [400 bar]的壓力，還能配上改進(jìn)的進(jìn)樣器，檢測(cè)器和色譜柱。高壓液相色譜法確實(shí)開始成為二十世紀(jì)七十年代中晚期的普遍分析方法。隨著這一期間不斷的性能改進(jìn)[更小顆粒，更高壓力], 字母縮寫保持一樣，但全稱變?yōu)楦咝?(high-performance) 液相色譜[HPLC]。高效液相色譜[HPLC]是目前分析化學(xué)十分強(qiáng)大的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物。今天，痕量化合物甚至低至千萬分之一[ppt]也可。