精確分析多肽、蛋白質(zhì)、聚合物甚至病毒顆粒的分子量,可以采用多種技術(shù)和方法。以下是對(duì)這些技術(shù)和方法的詳細(xì)歸納:
### 一、多肽和蛋白質(zhì)的分子量分析
1. **凝膠過濾法(SEC/GPC)**
* 原理:利用凝膠的分子篩作用,根據(jù)分子大小進(jìn)行分離。大分子物質(zhì)由于直徑較大不易進(jìn)入凝膠顆粒的微孔,而只能分布顆粒之間,所以在洗脫時(shí)向下移動(dòng)的速度較快,路程較短;小分子物質(zhì)除了可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外,還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中,即進(jìn)入凝膠相內(nèi),向下移動(dòng)的速度落后于大分子物質(zhì),路程較長(zhǎng)。因此分子越大的物質(zhì),通過色譜柱的時(shí)間越短,分子越小的物質(zhì),通過色譜柱的時(shí)間越長(zhǎng),這種現(xiàn)象又稱為分子篩現(xiàn)象。 * 優(yōu)點(diǎn):操作相對(duì)簡(jiǎn)單,對(duì)樣品的純度要求不高,可以提供分子量分布信息。 * 應(yīng)用:常用于蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的分子量測(cè)定。
2. **SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳**
* 原理:在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)和少量巰基乙醇,蛋白質(zhì)多肽類混合物的電泳遷移率將主要取決于它們的相對(duì)分子量,而與電荷和形狀無關(guān)。 * 優(yōu)點(diǎn):分辨率高,可以同時(shí)分離多個(gè)蛋白質(zhì)樣品。 * 應(yīng)用:廣泛用于蛋白質(zhì)純度和分子量的測(cè)定。
3. **質(zhì)譜法**
* 原理:利用電場(chǎng)、磁場(chǎng)等手段將待測(cè)分子電離成帶電離子,并根據(jù)其質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行分離和檢測(cè)。 * 優(yōu)點(diǎn):靈敏度高、分辨率高、適用范圍廣,可以精確測(cè)定分子量。 * 應(yīng)用:特別適用于蛋白質(zhì)、多肽等復(fù)雜生物分子的分子量測(cè)定,如電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)。
### 二、聚合物的分子量分析
1. **凝膠滲透色譜法(GPC)**
* 原理:與凝膠過濾法相似,利用不同分子量化合物在凝膠填料孔隙中的滲透能力差異進(jìn)行分離。 * 優(yōu)點(diǎn):可以提供分子量分布信息,適用于聚合物等大分子物質(zhì)的分子量測(cè)定。 * 應(yīng)用:廣泛用于聚合物分子量及分子量分布的測(cè)定。
2. **端基分析法**
* 原理:利用化學(xué)方法測(cè)定聚合物鏈端基團(tuán)的種類和數(shù)量來推算分子量。 * 優(yōu)點(diǎn):操作相對(duì)簡(jiǎn)單。 * 缺點(diǎn):只適用于具有明確端基的聚合物,如聚酯、聚酰胺等,且對(duì)于高分子量樣品的測(cè)定準(zhǔn)確度較差。 * 應(yīng)用:有限制地用于特定類型聚合物的分子量測(cè)定。
3. **質(zhì)譜法**
* 如飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)等,同樣適用于聚合物的分子量測(cè)定,具有高精度和高靈敏度。
### 三、病毒顆粒的分子量分析
1. **高效液相色譜(HPLC)結(jié)合光散射法**
* 原理:利用病毒顆粒在色譜柱上的分離以及光散射信號(hào)來測(cè)定其分子量。 * 優(yōu)點(diǎn):快速、準(zhǔn)確,適用于病毒顆粒等大分子的分子量測(cè)定。 * 應(yīng)用:廣泛用于病毒疫苗、病毒樣顆粒(VLP)等生物制品的分子量分析。
2. **動(dòng)態(tài)光散射(DLS)**
* 原理:通過測(cè)量病毒顆粒在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)來推算其粒徑和分子量。 * 優(yōu)點(diǎn):非侵入性、實(shí)時(shí)檢測(cè)。 * 應(yīng)用:適用于病毒顆粒的粒徑和分子量分布測(cè)定。
3. **電泳法**
* 如SDS-PAGE電泳,雖然主要用于蛋白質(zhì)和多肽的分子量測(cè)定,但在某些情況下也可用于病毒顆粒的亞基分子量分析。
### 四、綜合考量
1. **樣品特性**:根據(jù)樣品的性質(zhì)(如極性、分子量范圍、穩(wěn)定性等)選擇合適的方法。例如,對(duì)于極性大、分子量大的化合物如蛋白質(zhì)和多肽,電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)可能更為適用;而對(duì)于非極性、分子量較大的化合物如聚合物和某些病毒顆粒,基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜(MALDI-MS)可能更為合適。
2. **檢測(cè)精度和范圍**:不同的方法具有不同的檢測(cè)精度和適用范圍。例如,質(zhì)譜法通常具有最高的檢測(cè)精度和適用范圍;而凝膠過濾法和端基分析法則可能受限于樣品的分子量和純度。
3. **儀器設(shè)備和成本**:考慮實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的儀器設(shè)備和成本預(yù)算。例如,質(zhì)譜儀通常價(jià)格昂貴且需要專業(yè)的操作人員和維護(hù);而凝膠過濾法和電泳法則相對(duì)簡(jiǎn)單且成本較低。
綜上所述,精確分析多肽、蛋白質(zhì)、聚合物甚至病毒顆粒的分子量需要根據(jù)樣品特性、檢測(cè)精度和范圍以及儀器設(shè)備和成本等因素進(jìn)行綜合考慮和選擇。在實(shí)際應(yīng)用中,可能需要結(jié)合多種方法以獲得更準(zhǔn)確和全面的分子量信息。 |