PITC 衍生法分析 18 種氨基酸
方法：適用于 ChP. 2015 二部中《復(fù)方氨基酸注射液中氨基酸的測(cè)定》氨基酸分析步驟
1. 原理
這種分析氨基酸的方法基于柱前衍生步驟，衍生化反應(yīng)是在堿性條件下完成的，采用異硫氰酸苯酯和游離氨基酸反應(yīng)生成的 PTC-氨基酸衍生物可于 UV 254nm 處被檢測(cè)到。通過(guò) PITC 衍生法改善的氨基酸分離，同樣使其分析更有效。
圖 1. PITC 氨基酸衍生原理
2. 試劑
三乙胺溶液：將 1.4mL 1mol/L 三乙胺溶液和 8.6mL 乙腈混合均勻；
異硫氰酸苯酯溶液：配成 12.5μL/mL 的異硫氰酸苯酯的乙腈溶液（即 0.1mol/L）;
18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：溶解或稀釋一定量的 18 種氨基酸于 0.1mol/L 鹽酸中，配制成 0.5μmol/mL 的 18
種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
3. 衍生化
轉(zhuǎn)移 200μL 的 18 種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（或樣品溶液）入 1.5mL 塑料管中，加入 100μL 三乙胺溶液和 100μL 異硫氰酸苯酯溶液，混合，至于室溫下反應(yīng) 1h 后，加入 400μL 正己烷，渦旋振蕩 10min。取澄清的下層液，稀釋三倍后，用 0.45μm 濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣。
4. 液相色譜分析
色譜柱：ACE Excel SuperC18 5μm 250×4.6mm（貨號(hào)：EXL-1211-2546U）
流動(dòng)相：A：0.1mol/L 醋酸鈉溶液（用稀醋酸調(diào)節(jié) pH 值至 6.5）-乙腈（93：7） B：乙腈-水（80：20）
流速：1ml/min
時(shí)間(min)
流動(dòng)相 A（%）
流動(dòng)相 B（%）
0
100
0
15
85
15
18
76
24
25
60
40
30
60
40
30.01
0
100
50
0
100
50.01
100
0
70
100
0
進(jìn)樣體積： 5μl 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm 柱溫：36℃
注：這里梯度供參考，可根據(jù)儀器實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整
1. ASP，天冬氨酸；2. Glu，谷氨酸；3. Ser，絲氨酸；4. Gly，甘氨酸；5. His，組氨酸；
6. Arg，精氨酸；7. Thr，蘇氨酸；8. Ala，丙氨酸；9. Pro，脯氨酸；10. Tyr，酪氨酸；
11. Val，纈氨酸；12. Met，甲硫氨酸；13. Cys，胱氨酸；14. Ile，異亮氨酸；
15. Leu，亮氨酸；16. Phe，苯丙氨酸；17. Trp，色氨酸；18. Lys，賴氨酸。
